Új lehetőség a férfi meddőség okának felderítésében: A spermium DNS fragmentációs teszt

A férfi termékenység, akárcsak a női folyamatosan csökken az életkor előrehaladtával, csökkentve a pár esélyeit arra, hogy gyermekük lehessen. Ennek hátterében az életkor mellett az egészségtelen életmód (dohányzás, alkoholfogyasztás, elhízás), valamint környezeti ártalmak is állhatnak. Klinikai vizsgálatok rámutatnak arra, hogy a spermium minőségének új mutatója, és a potenciális termékenyítőképesség előrejelzőjének tekinthető a spermiumok DNS-ének integritás vizsgálata. Magyarországon a klinikumban nem használják rutinszerűen a spermiogramok elkészítése során. A férfi termékenységi vizsgálat hagyományos módja a spermiumok számlálása, azok alakjának (morfológia) és mozgásának (motilitás) vizsgálatából áll.

Legújabb klinikai adatok szerint a spermiumban lévő DNS-károsodások is állhatnak a férfi termékenységi zavarok hátterében. Ha a spermiumok több mint 30 százaléka fragmentált (töredezett), a fogamzóképesség esélye jelentősen csökken (Barratt et al. 2010). A töredezett DNS-ű spermium legtöbb esetben nem képes megtermékenyíteni a petesejtet, illetve ha in vitro fertilizációs eljárás során termékenyítjük a petesejtet és fejlődésnek indul az embrió, akkor megállhat a fejlődésben, nem osztódik tovább, vagy nem tapad meg, emellett a klinikai adatok alapján a korai vetélés kockázata is jelentősen megnő (Aitken et al. 2007).

Több technika is létezik a spermiumok DNS fragmentációjának kimutatására, pl. TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end-labeling) vizsgálat, ami a DNS szabad végeit ún. ’nick’-eket detektál fluoreszcens jelölés segítségével (Aitken et al. 2009), Comet assay (gélelektroforézis alapú)(Aitken et al. 2007), SCSA (Sperm Chromatin Stucture Assay)(Evenson et al. 2002), spermium kromatin diszperziós (SCD: sperm chromatin dispersion) teszt (Fernandez et al. 2003). Széleskörű alap- és klinikai kutatásokkal támasztották alá a vizsgálat létjogosultságát a termékenyítőképesség, a blasztocisztává fejlődés és a sikeres terhességek létrejöttében az IVF (in vitro fertilizáció) kezelések során (Virro et al. 2004).

Ezen vizsgálatok hátránya, hogy nem alkalmazhatóak rutinszerűen a klinikai andrológiai vagy az asszisztált reprodukciós technológiai (ART) laboratóriumokban, eszközigénye, költséges volta miatt. Fernandez és munkatársai 2005-ben fejlesztették ki a Halosperm® tesztet, céljuk a spermium kromatin diszperziós (SCD) teszt továbbfejlesztése volt (Fernandez et al. 2005). A klinikumban arra van szükség, hogy a vizsgálat, amivel a spermiumok DNS fragmentáltságát vizsgálni lehet könnyen kivitelezhető, ismételhető, megbízható legyen, és ne igényeljen új, speciális és költséges eszközöket.

Az eljárásról röviden: a vizsgálat során a spermiumok DNS degradációját vizsgáljuk. A spermiumokat agaróz mikrogélben rögzítjük, ami szuszpenzió-szerű környezetet biztosít. Egy kezdeti savas kezeléssel a fragmentált DNS-t hordozó spermiumok DNS-e denaturálódik. Lízis oldattal eltávolítjuk a nukleáris fehérjéket, membránokat. A sejtmagi fehérjék eltávolítása nukleoidok (deproteinizált sejtmagok) keletkezését eredményezi, amelyekben a DNS hurkok kitekerednek. A mintákat festjük (Wright oldattal), majd fénymikroszkóppal vizsgáljuk. DNS törés, sérülés hiányában a spermiumok feje körül széles fényudvar (halo) látható, míg a sérült, töredezett, fragmentált DNS-t hordozó spermiumok feje körül kismértékű udvar látható, vagy egyáltalán nem látunk semmit.

Ha ez a fényudvar nagy, illetve közepes méretű a spermium fejéhez viszonyítva, akkor nincs DNS fragmentáció, ha kicsi, vagy nincs, akkor sajnos töredezett a DNS (1. ábra). A mintában %-os értékben adjuk meg a sérült, illetve ép DNS-sel rendelkező spermiumok arányát: DNS fragmentációs index (DFI). Azoknak a férfiaknak, akiknek a DFI értéke 30% feletti, nagyobb az esélyük az infertilitásra.

A spermium DNS-ének minősége, mint diagnosztikus eszköz, sokkal megbízhatóbbnak és előremutatóbbnak tűnik a korábbi, konvencionális paraméterekhez képest (koncentráció, motilitás, morfológia), a DNS károsodás mértékének megállapításával következtetni lehet a termékenységre, az IVF program sikerességére (Simon et al. 2010).

Irodalom

1. Aitken RJ, De Iuliis GN. Origins and consequences of DNA damage in male germcells. Reprod Biomed Online. 2007 Jun;14(6):727-33.

2. Aitken RJ, De Iuliis GN, McLachlan RI. Biological and clinical significance of DNA damage in the male germ line. Int J Androl. 2009 Feb; 32(1):46-56.

3. Barratt CL, Aitken RJ, Björndahl L, Carrell DT, de Boer P, Kvist U, Lewis SE, Perreault SD, Perry MJ, Ramos L, Robaire B, Ward S, Zini A. Sperm DNA: organization, protection and vulnerability: from basic science to clinical applications--a position report. Hum Reprod. 2010 Apr; 25(4):824-38. doi:10.1093/humrep/dep465

4. Evenson DP, Larson KL, Jost LK. Sperm chromatin structure assay: its clinical use for detecting sperm DNA fragmentation in male infertility and comparisons with other techniques. J Androl. 2002 Jan-Feb; 23(1):25-43.

5. Fernández JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, Vazquez R, Alvarez JG. The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. J Androl. 2003 Jan-Feb; 24(1):59-66.

6. Fernández JL, Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosálvez J, Enciso M, LaFromboise M, De Jonge C. Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test. Fertil Steril. 2005 Oct; 84(4):833-42.

7. Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE. Clinical significance of sperm DNA damage in assisted reproduction outcome. Hum Reprod. 2010 Jul;25(7):1594-608. doi: 10.1093/humrep/deq103

8. Virro MR, Larson-Cook KL, Evenson DP. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril. 2004 May; 81(5):1289-95.

Szerzők:

Dr. Vereczkey Attila – Versys Clinics Humán Reprodukciós Intézet orvosigazgatója,

Dr. Debreceni Diána PhD., - a Versys Clinics Humán Reprodukciós Intézet molekuláris biológusa