Az esszenciális foszfolipidek csökkentik az apoptózist és növelik a membrántranszportot humán hepatocyta sejtvonalakban

A nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD) és progresszív formája, a nem alkoholos steatohepatitis (NASH) hátterében egymással összefonódó anyagcsere-, gyulladásos, sejthalálozási és membrántranszport-folyamatok állnak. Az esszenciális foszfolipidek hepatoprotektív tulajdonságait korábbi klinikai és preklinikai adatok már vizsgálták, ugyanakkor a hatás sejtszintű mechanizmusairól kevés humán hepatocytákon nyert információ áll rendelkezésre.

A jelen kutatás az EPL-készítmény, illetve két foszfolipid-összetevője, a PPC és a PI hatását értékelte három humán hepatocytamodellben: HepG2-, differenciált HepaRG-, valamint sztearinsav- és olajsavkezeléssel steatosissá tett HepaRG-sejtekben. A szerzők három, a májfunkció szempontjából lényeges sejtszintű folyamatot helyeztek előtérbe: a plazmamembrán fluiditását, az apoptózist és az epe-, illetve xenobiotikumtranszportban részt vevő exportfehérjék működését.

Foszfolipidek és membránfluiditás

A sejtmembrán foszfolipid kettősrétegének fizikai tulajdonságai meghatározzák számos membránfüggő sejtfunkció, így a transzportfehérjék működését is. A membránfluiditást fluoreszcencia-anizotrópiával értékelték; az anizotrópia csökkenése a membrán fokozódó fluiditását jelezte.

A HepG2-sejtekben az EPL, a PPC és a PI egyaránt szignifikánsan, koncentrációfüggő módon csökkentette az anizotrópiát, tehát fokozta a membránfluiditást. Azonos, 0,1 mg/ml koncentrációban a PI esetében volt a legnagyobb anizotrópiacsökkenés, ezt az EPL, majd a PPC követte. A szerzők ugyanakkor hangsúlyozzák, hogy a különböző foszfolipidek közvetlen összehasonlítására statisztikai elemzés nem történt.

A differenciált HepaRG-sejtek esetében az EPL és a PPC egyik vizsgált koncentrációban sem változtatta meg szignifikánsan a membránfluiditást. E hatás csak az 1 mg/ml PI-kezelés mellett volt kimutatható. A steatoticus HepaRG-sejtekben szintén kizárólag a PI fokozta szignifikánsan a membránfluiditást; EPL- és PPC-kezelés mellett ilyen változás nem mutatkozott.

Az eredmények arra utalnak, hogy a membránfluiditásra kifejtett hatás erősen modellfüggő. A HepG2-sejtvonalban egységesen megfigyelhető változások nem ismétlődtek meg teljes mértékben a differenciált, illetve steatoticus HepaRG-sejtekben. Ez azért lényeges, mert a májbetegségekben a sejtmembrán lipidösszetétele és funkciója egyaránt módosulhat, a különböző sejtvonalak pedig eltérő anyagcsere- és transzportfehérje-expressziós jellemzőkkel rendelkeznek.

Apoptózis tamoxifenexpozícióban

Az apoptózis szerepet játszik a NAFLD kialakulásában és progressziójában. A kutatók a caspase-3/-7 aktivitását követték, a sejthalál indukálására pedig tamoxifent alkalmaztak. A foszfolipidek önmagukban egyik sejtvonalban sem váltottak ki szignifikáns apoptózist a vizsgált koncentrációkban.

A HepG2-sejtekben az EPL mindkét vizsgált koncentrációban szignifikánsan mérsékelte az 55 µM tamoxifen által kiváltott caspase-3/-7-aktivitást. A PPC antiapoptotikus hatása e modellben csak 1 mg/ml koncentrációban bizonyult szignifikánsnak. A PI mindkét alkalmazott koncentrációban csökkentette a magasabb dózisú tamoxifenhez társuló apoptózist.

A halott, SYTOX-pozitív sejtek arányának elemzése ugyancsak a HepG2-modellben mutatott kedvező hatásokat. Magasabb tamoxifenkoncentráció mellett az EPL, a PPC és a PI különböző mértékben csökkentette az elhalt sejtek arányát. PI esetén már alacsonyabb tamoxifenterhelés mellett is észleltek szignifikáns csökkenést az elhalt sejtek hányadában, de ez csak a magasabb PI-koncentrációnál jelent meg.

Ezzel szemben HepaRG-sejtekben sem az EPL, sem a PPC, sem a PI nem módosította szignifikánsan a tamoxifen által kiváltott caspase-3/-7-aktivitást. A sejthalál arányát tekintve egyes eltérések előfordultak: például 0,1 mg/ml PPC 45 µM tamoxifen jelenlétében növelte, míg 60 µM tamoxifen mellett csökkentette a halott sejtek arányát. A szerzők e megfigyeléseket nem értelmezték általános antiapoptotikus hatás bizonyítékaként.

A steatoticus HepaRG-sejtekben a foszfolipidkezelések sem a caspase-aktivitást, sem az elhalt sejtek hányadát nem befolyásolták szignifikánsan tamoxifen jelenlétében. A tanulmány alapján tehát az EPL, a PPC és a PI antiapoptotikus hatása főként a HepG2-sejtekben volt kimutatható, míg a differenciált HepaRG-alapú modellekben nem igazolódott.

Epe- és xenobiotikumtranszport

A hepatocyták kanalikuláris membránjának transzportfehérjéi nélkülözhetetlenek az epesavak, szerves anionok, xenobiotikumok és endogén metabolitok kiválasztásában. A szerzők négy ATP-kötő kazetta transzporter aktivitását vizsgálták: a BCRP-t, az MRP-2-t, a BSEP-et és a P-glikoproteint (P-GP).

A HepG2-sejtekben az EPL és a PI fokozta a BCRP-mediált transzportot, míg a PPC nem módosította azt. Az MRP-2 működésére e sejtvonalban egyik foszfolipidkezelés sem gyakorolt szignifikáns hatást. Mindhárom vizsgált foszfolipid fokozta viszont a P-GP-mediált transzportot valamennyi alkalmazott koncentrációban.

Az EPL és a PPC a HepG2-sejtekben a BSEP működését is fokozta. Az EPL 0,25 mg/ml koncentrációban növelte a fluoreszcens epesav, a 7-béta-NBD-taurocholát kanalikuláris felhalmozódását, amely a BSEP-aktivitás és az epesavsóexport fokozódását jelzi. A PPC mindkét vizsgált koncentrációban jelentősen fokozta ezt a folyamatot. PI-kezelés mellett ugyanakkor nem történt szignifikáns változás a BSEP-aktivitásban.

A differenciált HepaRG-sejtekben más transzportmintázat rajzolódott ki. A BCRP és a BSEP aktivitását egyik kezelés sem befolyásolta szignifikánsan. Az MRP-2-mediált transzportot ugyanakkor az EPL mindkét koncentrációja, az 1 mg/ml PPC, valamint a PI mindkét vizsgált koncentrációja fokozta. A P-GP aktivitását HepaRG-sejtekben csak az 1 mg/ml PI növelte.

A steatoticus HepaRG-sejtekben az EPL és a PPC elsősorban a BSEP működésére hatott: az EPL 0,25 mg/ml koncentrációban, a PPC pedig mindkét dózisban fokozta az epesavsóexportot. PI-kezelés mellett e sejtekben a BSEP-aktivitás nem változott, viszont a magasabb, 1 mg/ml-es koncentráció növelte az MRP-2- és a P-GP-mediált transzportot. A BCRP aktivitása egyik foszfolipid mellett sem módosult szignifikánsan.

A BSEP különös figyelmet érdemel, mert az epesavak canalicularis effluxának sebességmeghatározó transzportere. A szerzők rámutatnak, hogy a BSEP májon belüli expressziója a NAFLD progressziójával csökkenhet, így az epeexportot érintő sejtszintű változások a steatohepatitis patomechanizmusában is relevánsak lehetnek.

A sejtvonalak közötti eltérések

A vizsgálat eredményeinek legfontosabb tanulsága, hogy a három modellben kapott hatások jelentősen különböztek. A legtöbb változást a HepG2-sejtekben mutatták ki: ebben a sejtvonalban fokozódott a membránfluiditás, csökkent a tamoxifen által kiváltott apoptózis, és több transzporter aktivitása is nőtt. A differenciált és a steatoticus HepaRG-sejtekben a hatások korlátozottabbak, illetve transzporterfüggők voltak.

Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy a HepG2- és HepaRG-sejtek gyógyszermetabolizáló enzim- és transzporterexpressziója, továbbá génexpressziós profilja eltérő. A szerzők szerint a differenciált HepaRG-sejtek génexpressziós mintázata összességében közelebb áll a primer humán hepatocytákéhoz és a humán májszövetéhez, mint a HepG2-sejteké. Emiatt az egyes modellrendszerekből származó eredményeket együtt kell értékelni.

A tanulmány további korlátja, hogy valamennyi alkalmazott modell immortalizált tumorsejtvonal volt, amely nem tükrözheti teljesen a normális májműködést. Nem ismert az sem, hogy az in vitro alkalmazott, nem citotoxikus foszfolipidkoncentrációk milyen viszonyban állnak az in vivo, hepatocytaszintű expozícióval. A kutatás kizárólag három mechanisztikus célpontot vizsgált; a gyulladásos citokinek és a lipidanyagcserében részt vevő enzimek vizsgálatát a szerzők külön közleményben tervezték ismertetni.